Dobrze tolerowany ekstrakt Spiruliny hamuje replikację wirusa grypy i zmniejsza śmiertelność wywołaną przez wirusy

- Dec 14, 2017 -

Dobrze tolerowany ekstrakt Spiruliny hamuje replikację wirusa grypy i zmniejsza śmiertelność wywołaną przez wirusy

Yi-Hsiang Chen, Gi-Kung Chang, Shu-Ming Kuo, Sheng-Yu Huang, I-Chen Hu, Yu-Lun Lo i Shin-Ru Shih


Abstrakcyjny

Grypa jest jedną z najczęstszych ludzkich chorób układu oddechowego i stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego. Jednak wysoka zmienność wirusów grypy utrudniła rozwój szczepionek i pojawiły się także oporne szczepy na istniejące leki przeciwwirusowe. Potrzebujemy pilnie nowych terapii przeciw grypie, aw tym badaniu opisujemy przeciwwirusowe właściwości ekstraktu z zimnej wody Spirulina ( Arthrospira platensis ). Już wcześniej doniesiono o działaniach przeciwwirusowych w przypadku ekstraktów i określonych substancji pochodzących z Spiruliny, a tutaj wykazujemy, że ten ekstrakt z zimnej wody Spirulina ma niską toksyczność komórkową i jest dobrze tolerowany w modelach zwierzęcych w jednej dawce wynoszącej nawet 5000 mg / kg. lub 3000 mg / kg / dzień przez 14 kolejnych dni. Badania nad skutecznością przeciw grypie wykazały, że ekstrakt Spiruliny hamował tworzenie wirusowych płytek w szerokim zakresie wirusów grypy, w tym szczepów odpornych na oseltamiwir. Stwierdzono, że ekstrakt z spiruliny działa we wczesnym stadium infekcji w celu zmniejszenia wydajności wirusów w komórkach i poprawy przeżycia u myszy zakażonych grypą, przy czym hamowanie hemaglutynacji wirusa grypy zidentyfikowano jako jeden z zaangażowanych mechanizmów. Łącznie wyniki te sugerują, że ekstrakt z zimnej wody z Spiruliny może służyć jako bezpieczny i skuteczny środek terapeutyczny do zwalczania ognisk grypy, a dalsze badania kliniczne mogą być uzasadnione.


Wprowadzenie         

Grypa jest jedną z najczęstszych chorób układu oddechowego u ludzi 1 i jest znana z wysokiej zachorowalności i śmiertelności, szczególnie u osób młodych, osób starszych i przewlekle chorych. Wirusy grypy powodują każdego roku wybuchy epidemii, a także sporadyczne pandemie, które mogą się szybko rozprzestrzeniać i zarażać do 50% dotkniętych populacji 1 . Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) oszacowała, że ​​na całym świecie 3-5 milionów przypadków ciężkiej choroby i 250 000-500 000 zgonów rocznie można przypisać sezonowej grypie 2 , podczas gdy pandemie mogą przynieść jeszcze większą opłatę 3 , 4 . Oprócz śmiertelności grypa powoduje również duże obciążenie ekonomiczne i medyczne społeczeństwa i stanowi poważny problem zdrowia publicznego, któremu należy skutecznie zaradzić.

Spośród wirusów grypy wirus grypy A jest jedynym rodzajem, o którym wiadomo, że powoduje pandemie 5 . Szczepy wirusa grypy A są zazwyczaj klasyfikowane zgodnie z antygenem ich powierzchniowych glikoprotein hemaglutyninowych (HA) i neuraminidazowych (NA). HA, którego jest 18 znanych podtypów (H1-H18) 1 , 5 , jest niezbędna do infekcji, ponieważ reguluje wiązanie wirusa z receptorami komórek gospodarza i ułatwia fuzję błon wirusowych i endosomalnych, aby umożliwić wejście genomu wirusowego do komórki gospodarza 6 . NA, z których 11 podtypów (N1-N11) zostało zidentyfikowanych5, jest ważna dla replikacji wirusa, ponieważ rozszczepia ona grupy kwasu sialowego wiążące nowo wytworzone cząsteczki wirusa z powierzchnią komórek gospodarza, uwalniając w ten sposób wirusy do infekowania innych gospodarzy 5 . Zjadliwość wirusa grypy prawdopodobnie wynika zarówno z wysokiego poziomu wiremii, jak i nadmiernie agresywnej odpowiedzi immunologicznej gospodarza, które łączą się, wywołując rozległe stany zapalne i apoptozę 7 , 8 . Leki przeciwwirusowe, takie jak inhibitory kanału jonowego M2 (np. Amantadyna, rimantadyna) lub inhibitory NA (np. Oseltamiwir, zanamiwir) są obecnie dostępne w celu zapobiegania lub leczenia grypy, ale pojawienie się opornych szczepów wirusowych może ostatecznie ograniczyć ich skuteczność 6 . Szczepienie jest najskuteczniejszą strategią zapobiegania grypie, ale terminowe opracowywanie szczepionek pozostaje trudne, ze względu na trudność w przewidywaniu dokładnego szczepu wirusa, który może pojawić się w następstwie wybuchu epidemii lub pandemii. Dlatego pilnie potrzebne są nowe terapie przeciw grypie, które mają skuteczność wobec szerokiego zakresu szczepów wirusa grypy, w celu poprawy wyników leczenia i skutecznego radzenia sobie z epidemiami.

Spirulina (Arthrospira platensis), to swobodnie pływające nitkowate cyjanobakterie, które mają długą historię zarejestrowanych zastosowań. Istnieją dowody na to, że cywilizacje Majów i Azteków powszechnie spożywały suszone ciastka Spirulina w czasach przedkolumbijskich, i przez stulecia społeczności w Afryce Środkowej zbierały Spirulinę z wód Jeziora Czad do użytku jako żywność 9 , 10 . Spirulina otrzymała znaczną uwagę ze względu na zawartość białka 60-70% i wysokie stężenia kwasów fenolowych, tokoferoli, niezbędnych kwasów tłuszczowych i witamin z grupy B 10 , 11 . Odnotowano, że ekstrakty z Spiruliny mają wiele efektów terapeutycznych, w tym redukcję cholesterolu, immunomodulację, działanie przeciwutleniające, przeciwnowotworowe i przeciwwirusowe 11 .

W tym badaniu przeprowadziliśmy testy komórkowe i badania na zwierzętach, aby ocenić wpływ wyciągu z zimnej wody A. platensis (ekstraktu Spirulina) na żywotność i patogenność kilku szczepów wirusa grypy A. Nasze wyniki pokazały, że ten ekstrakt Spiruliny hamował tworzenie wirusowych płytek i zmniejszał replikację wirusa w hodowlach komórkowych i wykazano, że jest bezpieczny i dobrze tolerowany w dużych dawkach w badaniach toksyczności komórkowej i na zwierzętach. Ponadto myszy zainfekowane wirusem grypy, którym podano ekstrakt Spirulina, miały wyższy wskaźnik przeżywalności w porównaniu z kontrolami traktowanymi podłożem. Następnie staraliśmy się zidentyfikować związane z tym mechanizmy i odkryliśmy, że ekstrakt z Spiruliny zakłócił hemaglutynację cząstek wirusa do erytrocytów, hamując w ten sposób proces infekcji. Łącznie wyniki te sugerują, że ekstrakt z zimnej wody z Spiruliny może uzasadniać dalsze badania kliniczne jako potencjalną terapię w leczeniu grypy.


Wyniki                           

Ekstrakt spiruliny hamuje tworzenie się płytki nazębnej w szerokim zakresie szczepów grypy

Początkowo ocenialiśmy przeciwwirusowe właściwości ekstraktu Spiruliny za pomocą testu redukcji łysinek. Jednowarstwowe komórki MDCK hodowane w 6-studzienkowych płytkach infekowano odpowiednio ~ 50 jednostek tworzących łysinki (PFU) / studzienkę grypy A / WSN / 33 (H1N1), A / TW / 3446/02 (H3N2) lub B / TW / 70555/05 szczepy wirusa (ryc. 1a), a także wirusy grypy A / TW / 70058/2009 (H1N1) lub A / TW / 147/2009 (H1N1) oporne na oseltamiwir (ryc. 1b). Komórki traktowano 0,375, 0,75, 1,5 lub 3,0 mg / ml ekstraktu Spirulina, które umieszczano w odpowiednich odstępach wokół szorstkiego EC50 wynoszącego 0,955 mg / ml, jak określono z poprzedniego testu neutralizacji przeciwko grypie A / WSN / 33 (H1N1). ), w tym samym czasie, w którym dodano wirusa, a następnie inkubowano przez 48 godzin, po czym komórki utrwalono i wybarwiono, a płytki wirusowe określono ilościowo. W porównaniu do nietraktowanych kontroli, dodatek 0,375, 0,75, 1,5 lub 3 mg / ml ekstraktu z Spiruliny doprowadził odpowiednio do 12,12%, 22,90%, 58,73% lub 89,00% hamowania wirusowej łysinki dla A / WSN / 33 (H1N1) szczepu, z porównywalną zależną od dawki szybkością hamowania obserwowaną dla innych testowanych szczepów wirusa, w tym szczepów opornych na oseltamiwir (ryc. 1a, b). Co ważne, 3 mg / ml ekstraktu Spiruliny całkowicie zahamowało tworzenie wirusowych płytek w A / TW / 3446/02 (H3N2), B / TW / 70555/05 i opornym na oseltamiwir A / TW / 147/09 (H1N1) szczepy (ryc. 1a, b). Korzystając z wyników testu redukcji łysinek i nieliniowej funkcji regresji w oprogramowaniu GraphPad Prism, ustaliliśmy wartości ekstraktu EC50 Spiruliny na 1,17 ± 0,09 mg / ml dla szczepu A / WSN / 33 (H1N1), 0,98 ± 0,24 mg / ml dla szczep A / TW / 3446/02 (H3N2), 1,33 ± 0,15 mg / ml dla szczepu B / TW / 70555/05, 1,17 ± 0,09 mg / ml dla szczepu A / TW / 70058/09 (H1N1) i 0,98 ± 0,10 mg / ml dla szczepu A / TW / 147/09 (H1N1) (tabela 1). Następnie ocenialiśmy cytotoksyczność ekstraktu Spiruliny na komórkach MDCK za pomocą testu MTT i stwierdziliśmy, że CC50 wynosi 23,8 mg / ml; obliczono, że wskaźnik selektywności (SI), stosunek CC50 do EC50, wynosi 20,34 dla szczepu A / WSN / 33 (H1N1), 24,28 dla szczepu A / TW / 3446/02 (H3N2), 17,89 dla szczepu B / TW / 70555/05, 20.34 dla szczepu A / TW / 70058/09 (H1N1) i 24,28 dla szczepu A / TW / 147/09 (H1N1) (tabela 1). Ponadto, zmniejszenie wydajności wirusa określone przez wyniki infekcyjnej dawki tkankowej (TCID50) wykazało, że 0,2, 1,0 lub 2,0 mg / ml ekstraktu Spirulina koinkubowano z wirusem grypy A / TW / 04/2014 (H7N9) przez 60 minut , następnie dodanego do komórki MDCK razem przez 72 godziny były odpowiednio zdolne do hamowania 68,36%, 90% lub 94% wydajności wirusa (Fig. 1c). Test neutralizacji grypy dalej wykazał, że EC50 ekstraktu z Spiruliny dla szczepu pandemicznego A / TW / 126/2009 (H1N1) w 2009 r. Wynosiło 0,585 ± 0,02 mg / ml (tabela 1). Wyniki te pokazują, że ekstrakt z Spiruliny jest zdolny do hamowania replikacji wirusa i tworzenia się płytki nazębnej w szerokim zakresie szczepów wirusa grypy, w tym szczepów wykazujących oporność na oseltamiwir.


Figura 1: Ekstrakt z zimnej wody z Spirulina ( Arthrospira platensis ) hamuje replikację wirusa i tworzenie się płytki nazębnej w szerokim zakresie szczepów grypy in vitro .

Figure 1.jpg

(a) Szczepy wirusa grypy A / WSN / 33 (H1N1), A / TW / 3446/02 (H3N2) i B / TW / 70555/05 oraz ( b ) szczepy odporne na oseltamiwir A / TW / 70058 / 09 (H1N1) i A / TW / 147/09 (H1N1), rozmnażane na komórkach MDCK, wszystkie wykazywały zależną od dawki redukcję tworzenia płytki nazębnej po traktowaniu 0,375, 0,75, 1,5 i 3,0 mg / ml wyciągu z Spiruliny. Dane przedstawiają średnią ± SD dla trzech niezależnych eksperymentów. Istotność statystyczną określono za pomocą dwustronnego niesparowanego t-testu i wykorzystano jako podstawę do oznaczenia wyników jako ns, nieistotne; * P ≤ 0,05; ** P ≤ 0,01; lub *** P ≤ 0,001. ( c ) Test TCID50 wykazał, że ekstrakt Spiruliny zmniejszał wytwarzanie wirusa grypy A / TW / 04/2014 (H7N9).


Tabela 1: Aktywność przeciwwirusowa wyciągu z Spiruliny przeciwko szczepom wirusa grypy in vitro .


EC50 (mg / ml)

CC50 (mg / ml)

SI

A / WSN / 33 (H1N1)

1,17 ± 0,09

23,80

20,34

A / TW / 3446/2002 (H3N2)

0,98 ± 0,24

23,80

24,28

B / TW / 70555/2005

1,33 ± 0,15

23,80

17,89

A / TW / 70058/2009 (H1N1) *

1,17 ± 0,08

23,80

20,34

A / TW / 147/2009 (H1N1) *

0,98 ± 0,10

23,80

24,28

A / TW / 126/2009 (H1N1)

0,58 ± 0,02

23,80

41,03

EC50: 50% skuteczne stężenie, w oparciu o hamowanie tworzenia wirusowej płytki nazębnej.

CC50: stężenie cytotoksyczne 50%, w oparciu o test MTT.

SI: wskaźnik selektywności, stosunek CC50 do EC50.

* Szczepy wirusa grypy oporne na Oseltamiwir.

Wszystkie dane reprezentują średnią ± SD dla trzech niezależnych eksperymentów.



Ekstrakt spiruliny jest bezpieczny i dobrze tolerowany w dużych dawkach

Ponieważ wykazano, że ekstrakt Spirulina ma aktywność przeciwgrypową o szerokim spektrum działania w testach komórkowych, staraliśmy się również o ocenę bezpieczeństwa biologicznego ekstraktu z Spiruliny in vivo. Przeprowadzono 14-dniowe badanie toksyczności ostrej doustnej u szczurów Sprague-Dawley, stosując dawki 0, 1000, 3000 lub 5000 mg / kg ekstraktu z Spiruliny. Objawy kliniczne, masę ciała i śmiertelność monitorowano przez 15 dni, a zmiany masy ciała śledzono osobno u samców (Fig. 2a) i samic (Fig. 2b). Wyniki nie wykazały znaczących różnic w śmiertelności, masie ciała lub ogólnej zmianie masy ciała w przypadku poddanych i nieleczonych kontroli. Nie stwierdzono żadnych zmian u żadnego szczura podczas sekcji przeprowadzonych pod koniec badania. Na podstawie tych wyników ustaliliśmy, że 14-dniowa mediana letalnej dawki (LD50) ekstraktu z Spiruliny będzie prawdopodobnie większa niż 5000 mg / kg. Następnie przeprowadziliśmy 14-dniowe badanie toksyczności po podaniu doustnym (podostrym) na szczurach Sprague-Dawley, którym kolejno podawano 750, 1500 lub 3000 mg / kg / dzień ekstraktu z Spiruliny przez 14 dni. Masę ciała monitorowano w dniu 1, dniu 8 i dniu 14, a zmiany śledzono osobno u samców (ryc. 2c) i samic (ryc. 2d). W trakcie badania nie obserwowano zgonów u żadnego szczura; ponadto nie zaobserwowano znaczących różnic w masie ciała między grupami leczonymi i nieleczonymi. Przeprowadzono również badania okulistyczne, analizę moczu, testy hematologiczne (tabela uzupełniająca S1), testy krzepnięcia krwi i testy chemii surowicy (tabela uzupełniająca S2) i nie obserwowano żadnych znaczących różnic w grupach leczonych, z wyjątkiem faktu, że asparaginowa aktywność aminotransferazowa (AST ) i poziomy transaminazy alaninowej (ALT) zmniejszyły się w grupach leczonych 3 000 mg / kg / dzień ekstraktu z Spiruliny (tabela uzupełniająca S2). Zgodnie z tymi wynikami, doszliśmy do wniosku, że nie zaobserwowany poziom szkodliwego działania (NOAEL) dla ekstraktu z Spiruliny może wynosić nawet 3000 mg / kg / dzień. Odkrycia te pokazują, że ekstrakt z Spiruliny jest bezpieczny i dobrze tolerowany, nawet gdy bardzo duże dawki są podawane w krótkim czasie. Oceniano również mutagenność ekstraktu Spirulina. W celu oceny genotoksyczności do 5 000 μg / ml ekstraktu z Spiruliny przeprowadzono test samosądów z użyciem Salmonella typhimurium. Podczas testowanych wysokich dawek nie zaobserwowano odwrotnej mutacji. Test aberracji chromosomowych przeprowadzono również w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO), stosując do 5000 μg / ml ekstraktu Spirulina i nie wykryto aberracji chromosomowych dla badanych dawek.


Rycina 2: Krótkoterminowa ostra i podostra toksyczność doustna dla ekstraktu Spirulina.

Figure 2.jpg


(a) 14-dniowe badanie toksyczności ostrej doustnej przeprowadzono na szczurach Sprague-Dawley otrzymujących 0, 1000, 3000 lub 5000 mg / kg wyciągu z Spiruliny. Zmiany masy ciała śledzono dla (a) samców i (b) samic szczura podczas okresu badania i nie obserwowano żadnych znaczących zmian. (a) Przeprowadzono również 14-dniowe badanie podostre, w którym szczury Sprague-Dawley poddano powtarzanemu dawkowaniu z 750, 1500 lub 3000 mg / kg / dzień ekstraktu z Spiruliny przez 14 kolejnych dni. Zmiany masy ciała u samców szczurów (c) płci męskiej i (d) mierzono w dniu 1, dniu 8 i dniu 14. Wszystkie dane przedstawiono jako średnią ± SD (N = 10).

Ekstrakt spiruliny najbardziej skutecznie zakłóca replikację wirusa podczas wczesnego zakażenia

Ponieważ ekstrakt Spirulina wykazał szerokie spektrum działania przeciw grypie in vitro i stwierdzono, że ma niską toksyczność w modelach komórkowych, a ponadto jest wysoce tolerowany w modelach zwierzęcych, dodatkowo przeprowadziliśmy test addycyjny w celu oceny wpływu Ekstrakt spiruliny na replikację wirusa grypy na różnych etapach zakażenia grypą, w celu zbadania możliwych mechanizmów przeciw grypie ekstraktu Spiruliny. Komórki MDCK zakażono szczepem A / WSN / 33 (H1N1) przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 2, a następnie potraktowano 2,5 mg / ml ekstraktu Spirulina w różnych punktach czasowych po zakażeniu (Fig. 3a). Po 9 godzinach od zakażenia pożywkę hodowlaną zastąpiono podłożem E0, a supernatanty zbierano następnie po 12 godzinach od zakażenia. Miana wirusa oceniano przy użyciu testów łysinkowych, jak opisano wcześniej 12 , a wyniki wykazały, że ekstrakt z Spiruliny bardziej skutecznie hamował wydajność wirusa, gdy był stosowany we wcześniejszych stadiach zakażenia wirusem (Fig. 3b). W porównaniu z nietraktowanymi kontrolami 90% wydajności wirusa zostało zahamowane, gdy ekstrakt Spirulina został dodany na godzinę przed zakażeniem (-1) lub bezpośrednio po zakażeniu (0). Przeciwnie, obserwowano odpowiednio 76%, 74% i 66% hamowanie wydajności wirusa, gdy ekstrakt Spirulina dodawano po 1, 2 i 3 godzinach po infekcji, i gdy dodawano ekstrakt Spirulina w 4, 5, 6, i 7 godzin po zakażeniu zaobserwowano odpowiednio tylko 18%, 18%, 20% i 12% hamowanie wydajności wirusa (Fig. 3b). Wyniki te sugerują, że wyciąg Spirulina działa poprzez zakłócenie procesu infekcji grypy lub przez zapobieganie replikacji wirusa w komórkach gospodarza.


Figura 3: Ekstrakt z Spiruliny działa w celu przerwania replikacji wirusa na wczesnym etapie infekcji.


Figure 3.jpg

(a) Przeprowadzono czas testu addycyjnego, w którym 2,5 mg / ml ekstraktu z Spiruliny dodano we wskazanych punktach czasowych do komórek MDCK zakażonych szczepem grypy A / WSN / 33 (H1N1). Pożywkę E0 nałożono na hodowlę w 9 godzin po zakażeniu, a supernatanty zebrano po 12 godzinach od zakażenia. (b) Plony wirusa zostały określone przez test łysinek i podane jako procent nietraktowanych kontroli. Dane przedstawiają średnią ± SD dla dwóch niezależnych eksperymentów. Analizę statystyczną przeprowadzono z dwustronnym niesparowanym testem t, a istotność statystyczną określono jako * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01 lub *** P ≤ 0,001 dla każdej grupy leczonej w porównaniu z kontrolą wirusa.


Ekstrakt z Spiruliny celuje w hemaglutyninę, aby zahamować rozwój wirusa grypy

Aby dalej wyjaśnić mechanizmy antygrypowe ekstraktu z Spiruliny we wczesnych stadiach zakażenia wirusem, przeprowadziliśmy eksperymenty mające na celu sprawdzenie, czy ekstrakt z Spiruliny działa bezpośrednio na wirusa grypy, czy też ogranicza liczbę komórek gospodarza w celu zapobiegania infekcji wirusowej. Najpierw 5 × 105P.FU wirusa grypy A / WSN / 33 (H1N1) inkubowano z 1,5, 3, 6 lub 12 mg / ml ekstraktu Spirulina przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Mieszaniny rozcieńczono następnie 104-krotnie, aż do uzyskania 50 PFU i utrzymywano nieznaczne stężenia ekstraktu Spiruliny, a testy łysinek przeprowadzono w celu oceny żywotności wirusa (Fig. 4a). W porównaniu z nietraktowanymi kontrolnymi, hodowle wirusowe potraktowane 1,5, 3, 6 i 12 mg / ml wyciągu z Spiruliny odpowiednio straciły 51,79%, 72,66%, 79,85% i 82,73% zdolności tworzenia łysinek (Fig. 4b). Ponadto, monowarstwowe komórki MDCK w 6-studzienkowych płytkach wstępnie traktowano 3,0 mg / ml ekstraktu Spirulina przez 2 godziny, po czym medium hodowlane zmieniono na świeżą pożywkę nie zawierającą ekstraktu Spirulina (grupa -3 ~ -1), lub traktowane 3 mg / ml ekstraktu Spirulina przed lub w tym samym czasie co adsorpcja wirusa (grupa -1 ~ 1). Po dodaniu 50 μF wirusa grypy A / WSN / 33 (H1N1) i adsorpcji wirusa prowadzonej przez dwie godziny w 37 ° C, do hodowli dodano 3 ml pożywki E0 zawierającej 0,3% agarozy, które następnie inkubowano do 48 godzin w 37 ° C (Fig. 4c). Udział procentowy tworzenia się płytki w grupie -3 ~ -1 wynosił 126,5% w porównaniu z nietraktowaną kontrolą wirusa; jednak odsetek tworzenia się płytki w grupie -1 ~ 1 wynosi tylko 48,9% w porównaniu z nieleczoną kontrolą (Fig. 4d). Wyniki te wskazują, że wyciąg z Spiruliny może bezpośrednio wpływać na wirus grypy, zamiast stymulować komórki gospodarza, aby zapobiec infekcji wirusowej. Biorąc pod uwagę, że wyciąg Spirulina przede wszystkim hamował replikację wirusów grypy we wczesnym stadium, wierzyliśmy, że hemaglutynina może być potencjalnym celem dla ekstraktu Spiruliny, ponieważ ta powierzchnia glikoproteiny wirusa grypy jest odpowiedzialna za przyłączenie wirusa i adsorpcję we wczesnej fazie infekcji. Dlatego przeprowadziliśmy test hamowania hemaglutynacji za pomocą czerwonych krwinek czerwonych świnek morskich (RBC). Hemaglutynina na powierzchni wirusa grypy może aglutynować RBC poprzez receptory powierzchni komórkowej związane z kwasem sialowym, podczas gdy cząsteczki wirusa mogą również wiązać się z RBC poprzez oddziaływanie hemaglutyniny z kwasem sialowym, tworząc charakterystyczne sieci, które można wyraźnie zaobserwować w mikropłytkach z okrągłym dnem. W przeciwieństwie do tego, RBC wytrącają się, tworząc plamkę przy braku aglutynacji. Stwierdziliśmy, że stężenie ekstraktu Spirulina w stężeniu 0,78 mg / ml przerwało wirusową hemaglutynację wirusa grypy A / WSN / 33 (H1N1), a podobne wyniki zaobserwowano dla grypy A / TW / 3446/2002 (H3N2) i B / TW / 70555/2005 również wirusy (ryc. 4e). Wskazuje to, że ekstrakt z Spiruliny może hamować szczepy wirusa grypy przez wpływ na hemaglutynację we wczesnym stadium zakażenia wirusem.


Figura 4: Ekstrakt spiruliny hamuje infekcję wirusem grypy przez zakłócanie hemaglutynacji.


Figure 4.jpg 

(a) 5 x 105 PFU wirusa grypy A / WSN / 33 (H1N1) inkubowano z 1,5, 3, 6 lub 12 mg / ml ekstraktu z Spiruliny w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, po czym hodowle poddano 104- krotnie rozcieńczenie, aby uzyskać próbki zawierające ~ 50 PFU i niewielkie ilości ekstraktu z Spiruliny, które następnie wykorzystano w teście łysinek do oceny żywotności wirusa. (b) Testy łysinkowe wykazały, że procent tworzenia się łysinek dla wirusów traktowanych ekstraktem Spiruliny był znacznie niższy niż dla nietraktowanych kontroli. Analizę statystyczną przeprowadzono z dwustronnym niesparowanym t-testem i wykorzystano jako podstawę do oznaczenia wyników jako ns, nieistotne; * P ≤ 0,05; ** P <> *** P <> (c) Monowarstwowe komórki MDCK w 6-studzienkowych płytkach traktowano 3 mg / ml ekstraktu Spirulina przez 2 godziny, po czym pożywkę hodowlaną zastąpiono świeżą pożywką nie zawierającą ekstraktu Spirulina (grupa -3 ~ -1), lub traktowane 3 mg / ml ekstraktu Spirulina tuż przed i podczas adsorpcji wirusa (grupa -1 ~ 1). 50 PFU wirusa grypy A / WSN / 33 (H1N1) dodano do hodowli w godzinie 0 i przeprowadzono test łysinkowy w celu oceny żywotności wirusa po 48 godzinach inkubacji. (d) Testy łysinkowe wykazały, że procent tworzenia się płytki nazębnej w grupie -3 ~ 1 był porównywalny z nietraktowaną kontrolą wirusa, podczas gdy tworzenie płytki nazębnej było znacząco hamowane w grupie -1 ~ 1. Analizę statystyczną przeprowadzono z dwustronnym niesparowanym t-testem i wykorzystano jako podstawę do oznaczenia wyników jako ns, nieistotne; * P ≤ 0,05; ** P ≤ 0,01; lub *** P ≤ 0,001 (e) Różne stężenia ekstraktu z Spiruliny dodano do 96-studzienkowych płytek zawierających 1% czerwonych krwinek świnek morskich i 4 jednostek HA grypy A / WSN / 33 (H1N1), A / TW / 3446 / Wirusy 02 (H3N2) lub B / TW / 70555/05. W kolumnie kontrolnej wirusa po prawej stronie nie dodano ekstraktu Spirulina. Wyniki wykazały, że stężenia ekstraktu Spirulina powyżej 0,78 mg / ml były zdolne do hamowania hemaglutynacji grypy.


Ekstrakt z wyciągu z wyciągiem z rodziny Spirulina poprawia przeżywalność u myszy zakażonych grypą

Biorąc pod uwagę, że ekstrakt z Spiruliny był dobrze tolerowany bez żadnej oczywistej toksyczności w modelach zwierzęcych, przeprowadziliśmy testy skuteczności anty-grypowej ekstraktu z Spiruliny w modelu myszy. 6-tygodniowe samice myszy BALB / c traktowano 5, 12,5 lub 25 mg / kg wyciągu z Spiruliny przez zgłębnik doustny 4 godziny przed infekcją. Myszy następnie poddano inokulacji donosowej wirusem grypy A / WSN / 33 (H1N1) (2,0 x 104 PFU / mysz), a 6 godzin później podano drugą dawkę ekstraktu Spirulina. W ciągu następnych 4 dni myszy otrzymywały dwie dzienne dawki ekstraktu Spirulina, co stanowiło całkowitą dawkę 10, 25 lub 50 mg / kg / dzień. Wskaźniki przeżycia monitorowano przez 14 dni po zakażeniu (Fig. 5), z dniem inokulacji zdefiniowanym jako Dzień 0. Wyniki pokazały, że doustne podawanie ekstraktu Spiruliny poprawiło przeżycie w porównaniu z nieleczonymi kontrolami; współczynniki przeżycia dla myszy leczonych ekstraktem Spirulina w stężeniu 0, 10, 25 lub 50 mg / kg / dzień wynosiły odpowiednio 0%, 20%, 40% i 60% w 14-dniowym okresie obserwacji, co sugeruje, że ekstrakt Spirulina może znacznie poprawić wyniki w zakażeniu grypą.


Figura 5: Ekstrakt z spiruliny poprawia wskaźniki przeżycia u myszy zakażonych grypą.

f5.jpg

Sześciotygodniowe samice myszy BALB / c inokulowano 2 x 104 PFU wirusa grypy A / WSN / 33 (H1N1), po otrzymaniu ekstraktu Spirulina 4 godziny przed infekcją przez zgłębnik żołądkowy. Ekstrakt spiruliny podawano ponownie 6 godzin po infekcji i następnie dwa razy dziennie przez 4 dni, w odpowiednich dawkach dziennych 10, 25 lub 50 mg / kg. Wskaźniki przeżycia uległy poprawie u myszy leczonych ekstraktem Spirulina, w porównaniu z kontrolnymi traktowanymi podłożem, które nie otrzymywały ekstraktu z Spiruliny. Analizy statystyczne krzywych przeżycia przeprowadzono przy użyciu testu Log-rank (Mantel-Cox), porównując każdą grupę traktowaną ekstraktem Spiruliny z grupą traktowaną podłożem (n = 5 myszy na grupę). * P <0,05, **="" p=""><>


Dyskusja

Wiele społeczeństw na całym świecie żyje w bliskim sąsiedztwie drobiu domowego i żywego inwentarza, co może zwiększyć szanse na przekwalifikowanie się wirusów pomiędzy wirusami grypy różnych gatunków żywicieli. W połączeniu z wygodą podróżowania w skali globalnej oznacza to, że wirusy grypy mogą ewoluować i rozprzestrzeniać się szybciej niż kiedykolwiek wcześniej, a kolejna pandemia grypy nie jest kwestią, czy, ale kiedy 1 , 13 . W przypadku wybuchu epidemii rozwój szczepionki często pozostaje w tyle za rozprzestrzenianiem się choroby, a wirusowe przesunięcie antygenowe oznacza, że ​​nowo opracowane szczepionki mogą stać się przestarzałe w ciągu kilku lat 1 . Istnieją również rosnące obawy o skuteczność leków przeciwwirusowych, ponieważ oporne szczepy grypy nadal pojawiają się 6 , 14 ; ponadto zgłoszono problemy bezpieczeństwa dotyczące oseltamiwiru 15 , jednego z najpowszechniej stosowanych inhibitorów NA w profilaktyce i leczeniu grypy. Potrzebne są nowe terapie przeciw grypie o szerokim zakresie skuteczności, aw tym badaniu zbadaliśmy wpływ zimnej wodnej ekstraktu Spiruliny na patogenność grypy. Ekstrakcja zimnej wody pomaga zachować aktywność biologiczną rozpuszczalnych substancji, takich jak białka i niektóre polisacharydy.

Stwierdzono, że zimny ekstrakt z Spiruliny jest bezpieczny i dobrze tolerowany przez szczury Sprague-Dawley w dawkach tak wysokich jak 5000 mg / kg dla ostrej toksyczności, co przewyższa najwyższą dawkę dla ludzi opisaną w literaturze do tej pory (20 g / dzień proszku A. platensis dla 6-kg niemowląt) 16 . Ponieważ ekstrakt z zimnej wody Spirulina stanowi około 20% biomasy dla proszku A. platensis, wyżej wspomniana dawka 20 g / dzień u 6-kg niemowląt odpowiada 3333 mg / kg / dzień proszku A. platensis, lub równa 666,6 mg. / kg / dzień ekstraktu z Spiruliny. Współczynnik konwersji dla dawek od ludzi do szczurów wynosi 6,17, co oznacza, że ​​ta dawka przekłada się na szczury na 4,113 mg / kg / dzień. Średnią dawkę 3000 mg / kg / dobę zastosowano do oceny podostrej toksyczności u szczurów w okresie 14 dni w tym badaniu. Dawki testowane na szczurach z grubsza przekładają się na pojedynczą dawkę 50 g lub dzienną dawkę 30 g przez 14 dni u 60 kg. Biorąc pod uwagę, że EC50 dla ekstraktu z Spiruliny mieści się w zakresie 1,0-1,3 mg / ml in vitro, i że dawki 10-50 mg / kg / dobę były wystarczające do poprawy przeżywalności u myszy zakażonych grypą, która wynosi 243,3 mg / kg / dzień u ludzi jest mało prawdopodobne, aby wysokie dawki stosowane w badaniach toksyczności były kiedykolwiek stosowane w warunkach klinicznych. Badania kliniczne na małą skalę wykazały, że dobowa 50-ml dawka ekstraktu z gorącej wody Spirulina zwiększała wytwarzanie interferonu-γ i funkcje komórek naturalnych zabójców (NK) u zdrowych ochotników płci męskiej 17 , podczas gdy dzienna dawka 2000 mg Spiruliny znacząco zmniejszała IL-4. poziomy do modulowania profili cytokin u pacjentów z alergicznym zapaleniem błony śluzowej nosa 18 . Ponadto pacjenci z nieżytem nosa leczeni tabletką zawierającą zaledwie 370 mg sproszkowanej spiruliny wykazywali znaczną poprawę objawów 19 . To pokazuje, że wyciąg Spirulina może wywierać działanie terapeutyczne w dawkach znacznie niższych niż testowane i uznane za bezpieczne w naszych badaniach toksyczności dla zwierząt.

Przeciwwirusowy potencjał A. platensis został już wspomniany i stwierdzono, że substancje takie jak spirulan wapnia (Ca-SP) z ekstraktu gorącej wody A. platensis są zdolne do hamowania infekcji i replikacji kilku wirusów otoczkowych in vitro, w tym wirus grypy A, ludzki wirus niedoboru odporności typu 1 (HIV-1), wirus opryszczki typu 1 (HSV-1), ludzki wirus cytomegalii, wirus odry i wirus świnki 20 , 21 , 22 , 23 . Stwierdzono również, że lipoproteiny typu Braun z ekstraktów z etanolu A. platensis wywierają działanie immunostymulujące na monocyty i komórki makrofagów, a ostatnie badania wykazały, że mogą uaktywniać odporność wrodzoną u myszy w celu ochrony przed poważną patogennością wywoływaną przez wirus grypy A ( H1N1) 24 . Wcześniejsza allofikocyjanina z czerwonymi białkami fluorescencyjnymi, oczyszczona z A. platensis, wykazała uprzednio, że hamuje syntezę RNA EV71 i tworzenie wirusowych płytek 25 . Stwierdzono, że wodny ekstrakt z A. platensis hamuje replikację HIV-1 w ludzkich limfocytach T, jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej i komórkach Langerhansa 26 . Chociaż lipoproteiny typu Ca-SP i typu Braun wyekstrahowane z A. platensis wykazują podobną aktywność przeciw grypie jak ekstrakt z zimnej wody Spirulina opisany w tym badaniu, nadal istnieją znaczne różnice między tymi substancjami. Na przykład aktywność przeciwwirusowa Ca-SP jest stabilna termicznie, podczas gdy ekstrakt z gorącej wody z ekstraktu Spirulina opisany w tym badaniu nie wykazywał działań przeciwwirusowych (tabela uzupełniająca S4), co sugeruje, że właściwości przeciwwirusowe wyciąg z zimnej wody Spirulina nie jest nadawany przez Ca-SP. Ekstrakt etanolowy z A. platensis, z którego ekstrahowano lipoproteiny typu Brauna, prawdopodobnie miałby inne składniki z ekstraktu zimnej wody, z powodu różnic w hydrofilowości podczas ekstrakcji. Ponadto wykazano, że lipoproteiny typu Braun chronią myszy przed zakażeniem grypą poprzez immunomodulację, w przeciwieństwie do bezpośredniej aktywności przeciwwirusowej obserwowanej w tym badaniu z użyciem ekstraktu Spirulina.

W celu przyszłego wdrożenia w badaniach klinicznych konieczne będzie określenie charakterystyki chemicznej i oceny aktywnego składnika ekstraktu Spirulina, a także odpowiednich środków kontroli jakości. Kompletna analiza chemiczna i objaśnienie związków czynnych wymagałyby znacznej ilości czasu i wysiłku, potrzebne byłyby różne rozpuszczalniki, techniki frakcjonowania i sprzęt analityczny, który obecnie jest poza zakresem tego badania. Jednak udało nam się zebrać podstawowy obraz składników chemicznych zawartych w ekstrakcie zimnej wody Spirulina, który wykazał zawartość 39,33 ± 5,6% białka, 11,79 ± 5,7% polisacharydów, 19,29 ± 2,7% kwasów nukleinowych, 5 ± 1% wody, 1,2 ± 0,3% popiołu i ~ 23,39% innych lub nieznanych składników (tabela uzupełniająca S3). C-fikocyjanina stanowi około 50% frakcji białkowej, która będzie głównym składnikiem ekstraktu zimnej wody Spirulina, podczas gdy allofikocyjanina zajmuje około 10%. Pod względem kontroli jakości identyfikacja i oznaczanie ilościowe związków czynnych byłyby dość użyteczne dla utrzymania spójności między partiami ekstraktu Spiruliny, ale jak dotąd nie jest to możliwe. Dokumentacja z Dalekiego Wschodu Bio-Tec Co., dostawcy ekstraktu z zimnej wody Spirulina, stwierdza, że ​​fluorescencyjne białko C-fikocyjanina jest obecnie stosowane jako parametr zastępczy do celów kontroli jakości. Podobnie jak w przypadku związków czynnych w ekstrakcie Spirulina do zwalczania grypy, C-fikocyjanina jest również wrażliwa na ciepło, dlatego wskaźnik jakości 18-22% zawartości C-fikocyjaniny w ekstrakcie z Spiruliny został wyznaczony jako miara długoterminowej stabilności . Ponadto, w naszych badaniach stosowano jako kontrolę biologiczną działanie przeciwzakaźne wyciągu z zimnej wody Spirulina (przeciw wirusowi grypy A / WSN / 33), jak oceniono za pomocą testu neutralizacji, w celu monitorowania skuteczności między różnymi partiami wyciągu Spirulina, jak również as long-term stability.

We have successfully separated the Spirulina extract into several different fractions, deriving a high molecular weight fraction of components >100 kDa; a polysaccharide-rich fraction from 70% ethanol precipitation; a negatively-charged molecule fraction (comprised of negatively-charged proteins, nucleotides, and polysaccharides) from DEAE ion-exchange column fractionation; a protein-depleted fraction from hot water extraction (HWE), and purified protein fractions containing only C-phycocyanin or allyphycocyanin (Supplementary Table S4). These fractions were tested against the influenza A/WSN/33 virus in anti-influenza neutralization tests, and the results are shown in Supplementary Table S4. The results of the neutralization tests suggest that the active compound(s) responsible for anti-influenza activity are likely to be high molecular weight (>100 kDa), heat-susceptible, and negatively charged polysaccharide(s). We will continue to examine each of these fractions in detail, and hope to elucidate the active substances involved in the near future.

On the other aspect, about 20% of Spirulina extract is made up of the protein C-phycocyanin, which has been reported to downregulate expression of the inflammatory factors iNOS and COX-2 in macrophages or lung tissue 27 , 28 , 29 . C-phycocyanin may also act as a selective COX-2 inhibitor to reduce inflammation 30 . In a salicylate-induced tinnitus mouse model, oral administration of C-phycocyanin was found to downregulate COX-2 mRNA expression in the cochlea and inferior colliculus 31 . It is currently believed that high virus load and a disproportionate host immune response are the two main factors driving influenza pathogenesis 7 , 8 , 32 , and thus the COX-2 inhibitory capabilities and anti-viral properties of the Spirulina extract might potentially act in tandem to improve outcomes in infected patients.

In conclusion, we show here that a cold water extract of Spirulina (Arthrospira platensis) was safe and well-tolerated in animal toxicity studies, and significantly inhibited virus infection and replication in a broad range of influenza viruses, including oseltamivir-resistant strains. Survival was also improved in influenza-infected mice treated with Spirulina extract. We found that the Spirulina extract acts by blocking hemagglutination of virus particles to inhibit influenza virus strains. Although it is possible that other anti-influenza mechanisms may be involved, and further research studies will certainly be needed, the fact is that anti-flu therapeutics are urgently needed due to the increasing prevalence of drug-resistant influenza strains. With a long history of food use, high tolerated dose, and broad spectrum of anti-influenza activities, Spirulina extract may serve not only as a viable therapy for the treatment of influenza, but also as a potential prophylaxis for the prevention of disease.


Methods

Cold water extraction of Spirulina (Arthrospira platensis)

The cold water extract of Spirulina was supplied by FEBICO (Far East Bio-Tec Co., Taipei, Taiwan). The Spirulina extract was prepared as follows: A. platensis powder was suspended in pure water with a ratio of 1:10, and the suspension was then rapidly frozen in a refrigerator below −20 °C to form a pellet. The pellet was subsequently thawed at 0–4 °C until completely de-frozen, and insoluble substances were removed by centrifugation for one hour. The supernatant was then lyophilized with freeze driers to derive powdered Spirulina extract containing concentrated levels of soluble biologically active substances.


Cell cultures and influenza viral strains

Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells were cultured in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Gibco, Gaithersburg, MD, USA), supplemented with 10% fetal bovine serum (Manufacturer, City, Country). Cells were maintained at 37 °C in a 5% CO2 atmosphere. The influenza A/TW/3446/02(H3N2), A/TW/438/07(H3N2), A/TW/70058/09(H1N1), A/TW/147/09(H1N1), A/TW/126/09(H1N1), B/TWN/70555/05, and A/TW/04/2014(H7N9) viruses were obtained from Chang Gung Memorial Hospital, and influenza A/WSN/33(H1N1) virus was purchased from the American Type Culture Collection (ATCC). Influenza virus strains were propagated in MDCK cells, and influenza A/TW/04/2014(H7N9) virus experiments were performed in a Biosafety Level 3 facility, while experiments with other influenza virus strains were performed in a Biosafety Level 2 facility, in accordance with governmental and institutional guidelines.


Plaque reduction assay

Monolayer MDCK cells in 6-well plates (1 × 106 cells/well) were infected with the respective influenza virus strains, with about 50 plaque-forming units (PFU)/well. Virus was allowed to adsorb to the cells for one hour at room temperature, and serial dilutions (0.375, 0.75, 1.5, or 3.0 mg/mL) of the Spirulina extract were then added respectively to each well at the same time for one hour. The cultures were subsequently overlaid with 3 mL of E0 DMEM containing 0.3% agarose and each dilution of Spirulina extract, then incubated for 48 hours at 37 °C. Afterwards, cells were fixed with 10% formaldehyde for 1 hour, and then stained with 0.5% of crystal violet. Plaques were visualized and counted to calculate half maximal effective concentration (EC50) values.


Cytotoxicity assay of Spirulina extract

MDCK cells were seeded in 96-well microplates (30,000 cells/well), and cultured in a humidified incubator for 24 hours. Culture media were then replaced with media containing Spirulina extract, at concentrations ranging from 0.048 to 50 mg/mL. A control group cultured in DMEM without Spirulina extract, and a blank group containing neither cells nor culture media, were also included. Cells were incubated for 72 hours, after which the culture medium was discarded and 20 μL of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) solution (1 mg/mL in DMEM) was added to each well. Cells were incubated for an additional 4 hours, and the MTT solution was then removed; subsequently, 200 μL of 0.04 N HCl in isopropanol was added to each well to dissolve the formazan crystals. Plates were then read on a microplate reader (BIOtAK, Bristol, UK) at absorbance of 570 nm (OD570). Four wells were used for each concentration of Spirulina extract, and the concentration resulting in 50% cell death compared with untreated controls (CC50) was calculated according to the Reed-Muench method.


Influenza virus neutralization test

The respective influenza virus strains were added to confluent MDCK cells in 96-well plates, which were then treated with serial concentrations of Spirulina extract and subsequently overlaid with 200 μL/well of E0 DMEM. After incubation at 37 °C for 64 hours, cells were fixed with 100 μL of 0.5% formaldehyde for one hour at room temperature, and then stained with 0.1% of crystal violet for 15 minutes at room temperature. Plates were then washed and dried, and the cellular densities of each well were measured with a microplate reader (BIOtAK) at OD570. The concentration of Spirulina extract required to reduce virus-induced cytopathic effects (CPE) by 50% compared to untreated controls was expressed as the EC50.


Virus yields percentage with TCID 50 evaluation

Influenza A/TWN/04/2014(H7N9) virus was co-incubated with 0, 0.2, 1, and 2 mg/mL of Spirulina extract for 60 mins. The mixtures were then serially-diluted 10-fold in E0-DMEM, and 100 μl of each diluted mixture was added to the corresponding wells of 96-well plates containing a monolayer of MDCK cells and 100 μl of E0 DMEM. Cultures were incubated for 3 days and then monitored with a microscope to calculate the TCID50 of each group according to the Reed-Muench method. Results from the 0.2, 1, and 2 mg/mL Spirulina extract-treated groups were compared to the 0 mg/mL virus control group to evaluate the virus yield percentage.


Time of addition assay

MDCK cells in 6-well plates were infected with influenza A/WSN/33(H1N1) virus at a multiplicity of infection (MOI) of 2, and then treated with Spirulina extract (2.5 mg/mL) at different timepoints post-infection. At 9 hours post-infection, the culture medium was replaced with E0 overlay medium (DMEM containing 100 U/mL of penicillin, 100 μg/mL of streptomycin, 2 mM of L-glutamine, and 0.1 mM of non-essential amino acid mixture), and supernatants from each well were collected at 12 hours post-infection. Virus titers were determined by plaque assay as previously described11.


Hemagglutination inhibition assay

Serially diluted influenza viral strains were respectively mixed with an equal volume of 1% guinea pig RBCs suspended in isotonic PBS in round-bottom 96-well plates, which were then incubated for 1 hour at 4 °C. The lowest concentration of virus to cause RBC agglutination was defined as one HA unit, and we subsequently treated 4 HA units of each respective influenza viral strain with serial dilutions of Spirulina extract for one hour at 4 °C, after which the viruses were respectively mixed with an equal volume of 1% guinea pig RBCs suspended in PBS in round-bottom 96-well plates, and incubated for another hour at 4 °C. The HI (hemagglutination inhibition) unit was defined as the lowest concentration of Spirulina extract capable of inhibiting viral hemagglutination.


Spirulina extract toxicity assays

Spirulina extract was assessed by the Ames test, with 50, 150, 500, 1,500, or 5,000 μg/plate of Spirulina extract added to induce reverse mutations in Salmonella typhimurium tester strains, in the absence or presence of S9 metabolic activation, in order to assess genotoxicity. A chromosome aberration assay was conducted in CHO cells treated with 50, 150, 500, 1,500, or 5,000 μg/ml of Spirulina extract in the absence or presence of S9, to evaluate the clastogenic potential of Spirulina extract. Acute toxicity studies of Spirulina extract were also conducted in vivo . A 14-day acute oral toxicity study was conducted in Sprague-Dawley rats, using doses of 0, 1,000, 3,000, or 5,000 mg/kg of Spirulina extract. Clinical signs, mortality, and body weight were monitored for 15 days, and necropsies were conducted at the end of the study. We further conducted a 14-day repeated dose (subacute) oral toxicity study in Sprague-Dawley rats, which were consecutively given 750, 1,500, or 3,000 mg/kg/day of Spirulina extract for 14 days. Body weight and mortality were tracked, and ophthalmologic examinations, urinalysis, haematology assays, blood coagulation assays, and serum chemistry assays were also conducted. The toxicology-associated studies were performed by the Center of Toxicology and Preclinical Sciences, Development Center for Biotechnology. All animal experiments were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of the Development Center for Biotechnology, and experimental animals were treated humanely in accordance with the National Institutes of Health guidelines on the ethical use of animals.


Survival analysis in a mouse model

BALB/c mice were purchased from BioLasco Biotechnology Company (Taipei, Taiwan) and housed in an environmentally-controlled room at a temperature of 25 ± 1 °C with a 12-hour light-dark cycle. Six-week-old female BALB/c mice were respectively treated with 5, 12.5, or 25 mg/kg of Spirulina extract by oral gavage at 4 hours prior to infection, and were subsequently subjected to intranasal inoculation with the influenza A/WSN/33 (H1N1) virus (2.0 × 104 PFU/mouse). Mice received a second dose of Spirulina extract at 6 hours post-infection, and the same doses were administered twice daily over the next 4 days, amounting to a daily dose of 10, 25, or 50 mg/kg/day of Spirulina extract. The day of inoculation was defined as Day 0, and survival rates were monitored for up to 14 days post-inoculation. Animal experimental protocols were conducted in accordance with the policies and procedures described in the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the National Institutes of Health, and were approved by the Chang Gung University review committee (IACUC approval number CGU11-109).


Analiza statystyczna

Data are expressed as mean ± SD. Statistical analysis was performed using GraphPad Prism software. Statistical significance was labelled as * P ≤ 0.05, ** P ≤ 0.01, and *** P ≤ 0.001.


Additional Information        

How to cite this article: Chen, Y.-H. et al. Well-tolerated Spirulina extract inhibits influenza virus replication and reduces virus-induced mortality. Sci. Rep. 6, 24253; doi: 10.1038/srep24253 (2016).


Referencje

1. Taubenberger, JK & Morens, DM The pathology of influenza virus infections. Annu. Rev. Pathol. 3, 499–522 (2008).

2. Tamerius, J. et al. Global influenza seasonality: reconciling patterns across temperate and tropical regions. Environ. Health Perspect. 119, 439–445 (2011).

3. Johnson, NP & Mueller, J. Updating the accounts: global mortality of the 1918–1920 “Spanish” influenza pandemic. Bull. Hist. Med. 76, 105–115 (2002).

4. Dawood, FS et al. Estimated global mortality associated with the first 12 months of 2009 pandemic influenza A H1N1 virus circulation: a modelling study. Lancet Infect. Dis. 12, 687–695 (2012).

5. Tong, S. et al. New world bats harbor diverse influenza A viruses. PLoS pathogens 9, e1003657, 10.1371/journal.ppat.1003657 (2013).

6. Neumann, G., Noda, T. & Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature 459, 931–939 (2009).

7. Zheng, BJ et al. Delayed antiviral plus immunomodulator treatment still reduces mortality in mice infected by high inoculum of influenza A/H5N1 virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 8091–8096 (2008).

8. Geiler, J. et al. N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibits virus replication and expression of pro-inflammatory molecules in A549 cells infected with highly pathogenic H5N1 influenza A virus. Biochem. Pharmacol. 79, 413–420 (2010).

9. Deng, R. & Chow, TJ Hypolipidemic, antioxidant, and antiinflammatory activities of microalgae Spirulina. Cardiovasc. Ther. 28, e33–e45 (2010).

10. Marles, RJ et al. United States pharmacopeia safety evaluation of spirulina. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 51, 593–604 (2011).

11. Karkos, PD, Leong, SC, Karkos, CD, Sivaji, N. & Assimakopoulos, DA Spirulina in clinical practice: evidence-based human applications. Evid. Based Complement. Alternat. Med. 2011, 531053 (2011).

12. Shih, SR et al. Pyrazole compound BPR1P0034 with potent and selective anti-influenza virus activity. J. Biomed. Sci. 17, 13 (2010).

13. Fineberg, HV Pandemic preparedness and response—lessons from the H1N1 influenza of 2009. N Engl J Med. 370, 1335–1342 (2014).

14. Ison, MG Antivirals and resistance: influenza virus. Curr. Opin. Virol. 1, 563–573 (2011).

15. Jefferson, T. et al. Oseltamivir for influenza in adults and children: systematic review of clinical study reports and summary of regulatory comments. BMJ 348, g2545 (2014).

16. Simpore, J. et al. Nutrition rehabilitation of HIV-infected and HIV-negative undernourished children utilizing spirulina. Ann Nutr Metab. 49, 373–380 (2005).

17. Hirahashi, T. et al. Activation of the human innate immune system by Spirulina: augmentation of interferon production and NK cytotoxicity by oral administration of hot water extract of Spirulina platensis. Int. Immunopharmacol. 2, 423–434 (2002).

18. Mao, TK, Van de Water, J. & Gershwin, ME Effects of a Spirulina-based dietary supplement on cytokine production from allergic rhinitis patients. J. Med. Food 8, 27–30 (2005).

19. Cingi, C., Conk-Dalay, M., Cakli, H. & Bal, C. The effects of spirulina on allergic rhinitis. Eur. Arch. Otorhinolaryngol. 265, 1219–1223 (2008).

20. Hayashi, K., Hayashi, T., Morita, N. & Kojima, I. An extract from Spirulina platensis is a selective inhibitor of herpes simplex virus type 1 penetration into HeLa cells. Phytother. Res. 7, 76–80 (1993).

21. Hayashi, T., Hayashi, K., Maeda, M. & Kojima, I. Calcium spirulan, an inhibitor of enveloped virus replication, from a blue-green alga Spirulina platensis. J. Nat. Prod. 59, 83–87 (1996).

22. Hayashi, K., Hayashi, T. & Kojima, I. A natural sulfated polysaccharide, calcium spirulan, isolated from Spirulina platensis: in vitro and ex vivo evaluation of anti-herpes simplex virus and anti-human immunodeficiency virus activities. AIDS Res. Hum. Retroviruses 12, 1463–1471 (1996).

23. Lee, JB et al. Effects of structural modification of calcium spirulan, a sulfated polysaccharide from Spirulina platensis, on antiviral activity. Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 49, 108–110 (2001).

24. Pugh, ND et al. Oral administration of a Spirulina extract enriched for Braun-type lipoproteins protects mice against influenza A (H1N1) virus infection. Phytomedicine 22, 271–276 (2015).

25. Shih, SR, Tsai, KN, Li, YS, Chueh, CC & Chan, EC Inhibition of enterovirus 71-induced apoptosis by allophycocyanin isolated from a blue-green alga Spirulina platensis. J. Med. Virol. 70, 119–125 (2003).

26. Ayehunie, S., Belay, A., Baba, TW & Ruprecht, RM Inhibition of HIV-1 replication by an aqueous extract of Spirulina platensis (Arthrospira platensis). J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 18, 7–12 (1998).

27. Cherng, SC, Cheng, SN, Tarn, A. & Chou, TC Anti-inflammatory activity of c-phycocyanin in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages. Life Sci. 81, 1431–1435 (2007).

28. Leung, PO, Lee, HH, Kung, YC, Tsai, MF & Chou, TC Therapeutic effect of C-phycocyanin extracted from blue green algae in a rat model of acute lung injury induced by lipopolysaccharide. Evid. Based Complement. Alternat. Med. 2013, 916590 (2013).

29. Shih, CM, Cheng, SN, Wong, CS, Kuo, YL & Chou, TC Antiinflammatory and antihyperalgesic activity of C-phycocyanin. Anesth. Analg. 108, 1303–1310 (2009).

30. Reddy, CM et al. Selective inhibition of cyclooxygenase-2 by C-phycocyanin, a biliprotein from Spirulina platensis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 277, 599–603 (2000).

31. Hwang, JH, Chen, JC & Chan, YC Effects of C-phycocyanin and Spirulina on salicylate-induced tinnitus, expression of NMDA receptor and inflammatory genes. PLoS One 8, e58215 (2013).

32. Lee, SM et al. Hyperinduction of cyclooxygenase-2-mediated proinflammatory cascade: a mechanism for the pathogenesis of avian influenza H5N1 infection. J. Infect. Dis. 198, 525–535 (2008).


Supplementary Information

S1.png


S2.png


S3.png


S4.png


Znajomość branży

Produkty powiązane

  • Natural Blue Pigment Spirulina Extract Powder Healthy Food Colorant
  • 100% czystej fikocyjaninę ekstrakt Spirulina E18
  • Liquid Spirulina Extract Blue Food Colorant
  • Naturalny Pigment jadalne ekstrakt Spirulina fikocyjaninę przeciwnowotworowe
  • Najbardziej pożywne naturalne jedzenie na ziemi
  • Naturalny niebieski kosmetycznych, najdrobniejszych proszku Spirulina