AUTOR

MAHIMA VEDI, SOWMIYA KALAISELVAN, MAHABOOBKHAN RASOOL, EVAN PRINCE SABINA *

ABSTRAKCYJNY

Cel: Niniejsze badanie przeprowadzono w celu oceny właściwości ochronnych Spirulina fusiformis przeciwko toksyczności indukowanej galaktozaminą u myszy albinosowych z cukrzycą. Metody: Oceniono transferazę glutaminianu szczawiooctanu (SGOT), transferazę pirogronianu surowicy glutaminianu (SGPT), fosfatazę alkaliczną (ALP), stężenie bilirubiny w surowicy (SBLN), stan antyoksydacyjny i TNF-α i porównano go ze standardową sylimaryną referencyjną. Wyniki: Wstrzyknięcie galaktozaminy znacząco zwiększyło poziomy SGOT, SGPT, SBLN i TNF-α w surowicy i spowodowało obniżenie statusu antyoksydacyjnego w wątrobie. Podanie Spirulina fusiformis zmieniło te parametry i zbliżyło je do normalnego poziomu. Wnioski: Wyniki tego badania wyraźnie wskazują, że Spirulina fusiformis wykazuje działanie hepatoprotekcyjne na toksyczność indukowaną galaktozaminą u myszy.

Słowa kluczowe: Spirulina, przeciwutleniacz, galaktozamina, hepatoprotekcja, sylimaryna

WPROWADZENIE

Wątroba jest ważnym narządem w organizmie, ponieważ powoduje metabolizm różnych związków egzogennych, jak również endogennych, czyniąc go bardziej podatnym na obrażenia. Galaktosamina (GalN) jest znana z wywoływania cech ostrego zapalenia wątroby, a jej toksyczne działanie wiąże się z niedoborem UDP-glukozy i UDP-galaktozy oraz utratą wewnątrzkomórkowej homeostazy wapnia. Wpływa to na metabolizm energetyczny, błony komórkowe i organelle oraz syntezę białek i kwasów nukleinowych [1, 2]. Spirulina to maleńka, jednokomórkowa, niebieskozielona alga, która była wykorzystywana jako źródło potencjalnych farmaceutyków, ponieważ składa się z białek, witamin, niezbędnych aminokwasów, minerałów i różnych niezbędnych nienasyconych kwasów tłuszczowych [3]. Ponadto Spirulina zawiera fotosyntetyczny pigment Fikocyjanina (PC), która ma właściwości przeciwutleniające i przeciwzapalne, a dzięki temu może mieć różne właściwości farmakologiczne Spiruliny [4-6]. Spirulina jest znana z tego, że wzmacnia układ odpornościowy i jest stosowana w leczeniu HIV i AIDS. [7] Wykazuje także działania antywirusowe [8], przeciwbakteryjne [9], przeciwpłytkowe [4], przeciw kardiotoksyczne [5, 6], hipocholesterolemiczne [10] i przeciwnadciśnieniowe [11]. Wykazano, że Spirulina zapobiega zaćmą [12], ostremu alergicznemu zapaleniu błony śluzowej nosa [13], niedokrwieniu mózgu [5, 6] i reaktywności naczyń [14], a także wykazano, że jest skuteczny w zapobieganiu toksyczności wywołanej kadmem [15] i arsenem [14] 16]. W ostatnich latach niektóre jego właściwości zostały potwierdzone w badaniach, podczas gdy dodatkowe właściwości farmakologiczne wymagają udowodnienia. Tak więc, niniejsze badanie przeprowadzono w celu oceny ochronnego działania Spirulina fusifomis przeciwko indukowanemu GalN uszkodzeniu wątroby u myszy.

MATERIAŁY I METODY

Zwierząt

Samce myszy szwajcarskich albinosów o masie około 25-30 gramów otrzymano z domu zwierząt, VIT University, Vellore. Zostały one aklimatyzowane przez tydzień w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i temperaturze z 12-godzinnym cyklem ciemnego światła i karmiono je komercyjnie granulowaną karmą Hindustan Lever Ltd. (Mumbai, Indie) i wodą ad libitum. Zwierzęta wykorzystane w tym badaniu były traktowane zgodnie z wytycznymi zalecanymi przez Komitet ds. Kontroli i Nadzoru Eksperymentów na Zwierzętach (CPCSEA), Ministerstwo kultury, Rząd Indii, Chennai.

Leki i środki chemiczne

Dostępne w handlu tabletki Spirulina otrzymano z Acumen pharmaceutical private Ltd, Pondicherry. Sylimaryna, standardowy hepatoprotekcyjny lek uzyskany z (Micro labs, Goa, India) i galaktozaminy, został uzyskany z SISCO Research Laboratories, Bangalore. Zarówno Silymarin jak i Spirulina fusiformis zostały rozpuszczone w wodzie destylowanej do użytku. Wszystkie inne stosowane odczynniki i chemikalia były standardowymi odczynnikami o czystości analitycznej od firm SRL, SD fine i innych firm chemicznych. Eksperymentalne myszy projektowe podzielono losowo na 5 grup po 6 zwierząt. Wszystkie zwierzęta zostały zmuszone do postu na 24 godziny przed rozpoczęciem badania. Grupy były następujące: Grupa I: grupa kontrolna, otrzymana sól fizjologiczna (0,89% NaCl, ip) Grupa II: grupa testowa indukowana galaktosaminą; hepatotoksyczność była indukowana przez pojedynczą dawkę galaktozaminy (700 mg / kg masy ciała, ip). Grupa III: Grupa leczona lekiem (Spirulina fusiformis + galaktozamina), Spirulina (100 mg / kg masy ciała, ip) była podawana po 30 minutach pojedynczego iniekcja galaktozaminy (700 mg / kg masy ciała, ip) Grupa IV: pozytywną grupę kontrolną (sylimaryna + galaktozamina), sylimarynę (25 mg / kg masy ciała, ip) podawano po 30 minutach pojedynczej iniekcji galaktozaminy (700 mg kg masy ciała, ip) Grupa V: Grupa kontrolna otrzymująca placebo, otrzymywała samą Spirulina fusiformis (100 mg / kg masy ciała, ip) Zwierzęta były ścięte po 4 godzinach od ostatniej dawki, a krew została pobrana z tułowia myszy i osocza oraz surowicę oddzielono. Tkanka wątroby myszy kontrolnych i doświadczalnych została wyizolowana i została wykorzystana do dalszej analizy biochemicznej i histopatologicznej.

Parametry biochemiczne

SGOT [17], SGPT [17], ALP [18], SBLN (diagnostyka autospan, Indie) i TNF-α (ELISA, Cayman Chemicals, USA) badano w surowicy myszy kontrolnych i doświadczalnych. Peroksydacja lipidów w tkance wątroby została określona za pomocą procedury Ohkawy et al. [19] przez pomiar malondialdehydu (MDA), który tworzy się jako produkt końcowy peroksydacji lipidów. Dysmutazę ponadtlenkową w tkance wątroby oceniano zgodnie z metodą Marklunda i Marklunda [20]. Katalazę badano metodą Sinha [21], reduktazę glutationu badano metodą Bellomo et al. [22], zredukowany glutation oceniano za pomocą metody Moron et al. [23] w tkance wątroby. Całkowite białko oszacowano przy użyciu Lowry's i in. [24] z użyciem albuminy surowicy bydlęcej w standardzie.

Badania histopatologiczne

Natychmiast po złożeniu część wątroby utrwalono w 10% formalinie, następnie przemyto odwodnioną w malejących stopniach izopropanolu i na koniec ksylenem. Tkankę zanurzono następnie w stopionym wosku parafinowym. Skrawki pocięto na 5 μm grubości, wybarwiono hematoksyliną i obserwowano pod mikroskopem.

Analiza statystyczna

Wyniki wyrażono jako średnią ± SD i przeprowadzono analizę statystyczną przy użyciu ANOVA, w celu określenia istotnych różnic między grupami, a następnie testu Newmana-Keula ucznia.

WYNIKI Wpływ Spirulina fusiformis na poziomy funkcjonalnych markerów wątroby u myszy traktowanych galaktozaminą Stwierdzono, że wątrobowe markery czynnościowe tj. Poziomy SGOT, SGPT, ALP i bilirubiny w osoczu były istotnie (p <0,05) wyższe="" u="" myszy="" leczonych="" galaktozaminą="" w="" porównaniu="" do="" kontroli.="" grupa="" (rysunek=""> Zostały one zbliżone do normalnych poziomów za pomocą leczenia Spirulina fusiformis, a podobne efekty zostały wykazane przez standardową sylimarynę lekową.

Dla każdej grupy n═6 wartości są średnie ± SD. Porównania wykonano w następujący sposób: grupa I vs. grupy II, III, IV i V. Analizę statystyczną obliczono za pomocą jednokierunkowej ANOVA, a następnie testu Studenta Newmana-Keula. * p <0,05 (istotne="">

Dla każdej grupy n═6 wartości są średnie ± SD. Porównania wykonano w następujący sposób: grupa I vs. grupy II, III, IV i V. Analizę statystyczną obliczono za pomocą jednokierunkowej ANOVA, a następnie testu Studenta Newmana-Keula. * p <0,05 (istotne="">

Dla każdej grupy n═6 wartości są średnie ± SD. Porównania wykonano w następujący sposób: grupa I vs. grupy II, III, IV i V. Analizę statystyczną obliczono za pomocą jednokierunkowej ANOVA, a następnie testu Studenta Newmana-Keula. * p <0,05 (istotne="">

Porównania wykonano w następujący sposób: grupa I vs. grupy II, III, IV i V. Analizę statystyczną obliczono za pomocą jednokierunkowej ANOVA, a następnie testu Studenta Newmana-Keula. * p <0,05 (istotne="">

Wpływ Spirulina fusiformis na poziomy mediatora zapalnego TNF-α u myszy leczonych galaktozaminą

Stwierdzono również, że poziomy mediatora stanu zapalnego TNF-α były zwiększone w wyniku uszkodzenia komórek w surowicy z Grupy II, tj. Myszy traktowanych galaktozaminą. Spirulina fusiformis była w stanie zapewnić istotną (p <0,05) ochronę="" przed="" uszkodzeniem,="" a="" zatem="" stwierdzono,="" że="" poziomy="" tnf-α="" są="" prawidłowe="" w="" grupie="" iii="" (fig.="">

Wpływ Spirulina fusiformis na status antyoksydantów u myszy leczonych galaktozaminą

Stwierdzono znaczące zmniejszenie poziomu przeciwutleniaczy (p <0,05) i="" zwiększenie="" peroksydacji="" lipidów="" u="" myszy="" leczonych="" galaktozaminą="" (tabela=""> Spirulina fusiformis była w stanie zmienić poziom przeciwutleniaczy i była w stanie zahamować peroksydację lipidów, co zaobserwowano w grupie III (tabela 1).

Tabela 1: Wpływ galaktozaminy na peroksydację lipidów i status antyoksydantów w osoczu myszy kontrolnych i doświadczalnych

Dla każdej grupy n═6 wartości są średnie ± SD. Porównania wykonano w następujący sposób: grupa I vs. grupy II, III, IV i V. Analizę statystyczną obliczono za pomocą jednokierunkowej ANOVA, a następnie testu Studenta Newmana-Keula. Jednostki: jednostki SOD / miligram białka (1 U = ilość enzymu, który hamuje autooksydację pirogalolu o 50%), mikromole CAT białka spożywanego H2O2 / minuta / miligram, reduktaza glutationowa-nmol utlenionego NADPH / min / mg białka , zredukowane glutationo-nanomole / miligram / białko, peroksydacja lipidów-nanomole powstałe w MDA / białko miligramowe. * p <0,05 (istotne="">

Odkrycia histopatologiczne

Z badań histopatologicznych (ryc. 5) można zauważyć, że reprezentatywne skrawki szczurów kontrolnych (ryc. 5A) pokazują żyłę centralną otoczoną normalnymi hepatocytami, podczas gdy w grupach traktowanych galaktosaminą (ryc. 5B) sekcje wątroby pokazują hepatocyty z powiększonymi jądrami skondensowana i zdyspergowana chromatyna, grupa leczona Spirulina + galaktozamina wykazała obecność centralnej żyły, a hepatocyty z reaktywnymi i prawidłowymi komórkami, grupa traktowana sylimaryną i galaktozaminą wykazała reaktywne hepatocyty (dwujądrowe) i prawidłowe ze zwyrodnieniowymi hepatocytami, a grupa, która otrzymała tylko Spirulinę, wykazała centralną żyłę i prawidłową hepatocyty z obcą cytoplazmą (Ryc. 5E).

DYSKUSJA

System modelowego eksperymentu indukowanego galaktozaminą u myszy jest uznawany za podobny do wirusowego zapalenia wątroby u ludzi, zarówno z punktu widzenia morfologicznego, jak i funkcjonalnego [25]. Oceniono hepatoprotekcyjny wpływ Spirulina fusiformis na uszkodzenie wątroby wywołane galaktozaminą i stwierdzono znaczną ochronę. Enzymy wątrobowe są związane z błoną i z powodu uszkodzenia komórek dochodzi do wycieku tych enzymów. Zatem ich ocena w surowicy jest użytecznym ilościowym markerem uszkodzenia hepatocytów [26]. Zwiększone poziomy SGOT, SGPT i ALP w tym badaniu mogą być interpretowane jako wynik zniszczenia komórki wątroby lub zmiany przepuszczalności błony i wskazywać na stopień uszkodzenia komórek wątrobowych powodowanego przez galaktozaminę. Leczenie Spirulina fusiformis osłabiło zwiększoną aktywność tych enzymów w surowicy spowodowaną przez galaktozaminę, jak zaobserwowano na Figurach 1 i 2. Można zasugerować, że działanie hepatoprotekcyjne Spirulina fusiformis może być spowodowane obecnością kilku aktywnych składników.

Kwantyfikacja bilirubiny w surowicy jest dowodem na ocenę czynności wątroby, a niezwykłe zwiększenie stężenia bilirubiny w surowicy wskazuje na poważne zaburzenie czynności wątroby [27]. Podwyższony poziom bilirubiny w tym badaniu jest zgodny z wcześniejszymi doniesieniami wykazującymi, że indukowane przez Galn zapalenie wątroby charakteryzuje się wzrostem stężenia bilirubiny w surowicy [28, 29]. Supresja zwiększonego stężenia bilirubiny za pośrednictwem Spiruliny u myszy z grupy III sugeruje, że Spirulina może wzmacniać dysfunkcję żółci (ryc. 3).

Wiadomo, że stres oksydacyjny odgrywa kluczową rolę w wielu chorobach, w tym w uszkodzeniu wątroby [30]. Tak więc aktywność przeciwutleniająca lub hamowanie wytwarzania wolnych rodników jest ważne w ochronie przed uszkodzeniem wątroby wywołanym galaktozaminą. Enzymy antyoksydacyjne, takie jak dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza i glutation, zapewniają ochronę przed uszkodzeniami tkanek oksydacyjnych [31]. Dymeraza nadtlenkowa jest skutecznym enzymem obronnym, który przekształca dysmutację anionów ponadtlenkowych w nadtlenki [32]. Katalaza to hemeproteina we wszystkich komórkach tlenowych metabolizujących nadtlenki do tlenu i wody. Reduktaza glutationowa jest cytozolowym enzymem wątrobowym zaangażowanym w detoksyfikację szeregu związków ksenobiotyków poprzez ich sprzęganie ze zredukowanym glutationem. Enzymy te stanowią wzajemnie wspierający się zespół obrony przed reaktywnymi formami tlenu. W niniejszym badaniu poziom MDA w wątrobie był zwiększony u myszy z odurzaniem galaktozaminą, podczas gdy zaobserwowano znaczny spadek enzymów przeciwutleniających (dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza, reduktaza glutationu) i całkowity zredukowany glutation (Tabela 1). Spirulina fusiformis była w stanie przywrócić poziom tych przeciwutleniaczy, wykazując działanie wychwytywania wolnych rodników.

Makrofagi, stres hepatocytów i / lub uszkodzenie mogą powodować wydzielanie sygnałów, które powodują aktywację innych komórek i są odpowiedzialne za wytwarzanie prozapalnych mediatorów i wydzielanie chemokin w celu dalszego rekrutowania komórek zapalnych do wątroby. Udowodniono, że cytokiny zapalne, takie jak czynnik martwicy nowotworów TNF-α, są zaangażowane w promowanie uszkodzenia tkanki [33]. Leczenie za pomocą Spirulina fusiformis zmniejsza uszkodzenie wątroby i zapalenie, a tym samym stabilizuje poziomy TNF-α (Figura 4).

Na podstawie badań histopatologicznych (ryc. 5) można zauważyć, że tkanka wątrobowa myszy leczonych Spirulina fusiformis była normalna w porównaniu z myszami leczonymi galaktozaminą.

WNIOSEK

Tak więc niniejsze badanie potwierdza działanie hepatoprotekcyjne Spirulina fusiformis przeciwko hepatotoksyczności indukowanej przez GalN u myszy. Skuteczność ochronna Spirulina fusiformis jest bardzo obiecująca, o czym świadczy odwrócenie zmienionych wartości po podaniu prawdopodobnie poprzez promowanie regeneracji hepatocytów, które przywracają integralność i zostało to potwierdzone w badaniach histopatologicznych. Własności hepatoprotekcyjne ekstraktu można przypisać obecności różnych składników obecnych w Spirulina fusiformis. Niezbędne są dalsze badania w celu poznania mechanizmu działania Spirulina fusiformis w celu zapewnienia ochrony przed hepatotoksycznością wywołaną galaktozaminą. Oświadczenie o konflikcie interesów

Oświadczamy, że nie mamy konfliktu interesów między nami.

REFERENCJE

1. Keppler D, Decker K. Badania nad mechanizmem galaktozaminy zapalenia wątroby: nagromadzenie 1-fosforanu galaktozaminy i jej hamowanie pirofosforylazy UDP-glukozy. Eur J Biochem, 1969, 10: 219-225.

2. Mangeney-Andreani M, Sire O, Montagne-Clavel J, Nordmann R, Nordmann J. Hamujący wpływ podawania D-galaktozaminy na utlenianie tłuszczów w hepatocytach szczura. FEBS Lett. 1982; 145: 267-270.

3. Mendes RF, Nobre BP, Cardoso MT, Peveira A, Palavra AF.Spercritical ekstrakcja dwutlenku węgla związków o znaczeniu farmaceutycznym z mikroalg. Inorganica Chem. Acta 2005; 356: 328-334.

4. Hsiao G, Chou PH, Shen MY, Chou DS, Lin Ch, Cheu JR. C-Fikocyjanina, bardzo silny i nowy inhibitor agregacji płytek z Spirulina platensis. J. Agric. Food Chem. 2005; 53 Suppl 20: 7734-7740.

5. Khan M, Shobha JC, Mohan IK, Naidu MU, Sundaram C, Singh S, i in. Wpływ Spiruliny na kardiotoksyczność zmniejszoną doksorubicyną. Phytother. Res. 2005a; 19 Suppl 12: 1030-1037.

6. Khan M, Varadhara S, Gansesa LP, Shobha JC, Naidu MU, Parmandi NL i in. C-fikocyjanina chroni przed uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym serca poprzez zaangażowanie sygnalizacji p38 i ERK. Rano. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2005b; 290 Suppl 5: H2136-H2145.

7. Herbaty J, Herbert JR, Fitton JH, Zimba PV. Algi - HAART biednego człowieka? Medical Hypotheses 2004; 62 Suppl 4: 507-510.

8. Herna'ndez-Corona A, Meckes M, Chamorro G, Barron ML. Przeciwwirusowa aktywność Spirulina maxima przeciwko wirusowi opryszczki pospolitej typu 2. Antivir. Res. 2002; 56 Suppl 3: 279-285.

9. Ozdemir G, Karabay NU, Dalay M, Pazarbasi B. Aktywność przeciwbakteryjna składnika lotnego i różnych ekstraktów z Spirulina platensis. Phytother. Res. 2004; 18 Suppl 9: 754-757.

10. Nagaoka S, Shimizu K, Kaneko H, Shibayama F, Morikawa K, Kanamaru Y, et al. Nowe białko C-fikocyjanina odgrywa kluczową rolę w hipocholesterolemicznym działaniu koncentratu Spirulina platensis u szczurów. J. Nutr. 2005; 135 Suppl 10: 2425-2430.

11. Khan M, Shobha JC, Mohan IK, Rao Naidu MU, Prayag A, Kutala VK. Spirulina łagodzi nefrotoksyczność wywołaną cyklosporyną u szczurów. J. Appl. Toksykol. 2006; 26 Suppl 5: 444-451.

12. Haque SE, Gilani KM. Wpływ ambroksolu, spiruliny i witaminy-E na zaćmę wywołaną naftalenem u samic szczura. Indian J. Physiol. Pharmacol. 2005; 49 Suppl 1: 57-64.

13. Mao K, Van de Water J, Gershwin ME. Wpływ suplementu diety na bazie Spiruliny na produkcję cytokin u pacjentów z alergicznym zapaleniem błony śluzowej nosa. J. Med. Food 2005; 28 Suppl 1: 27-30.

14. Mascher D, Paredes-Carvajal MC, Torres-Dura'n PV, Zamora-Gonza'lez J, Dı'az-Zagoya JC, Jua'rez-Oropeza MA. Etanolowy ekstrakt z Spirulina maxima zmienia reaktywność naczyń krwionośnych pierścieni aortalnych z otyłych szczurów. Łuk. Med. Res. 2005; 37 Suppl 1: 50-57.

15. Jeyaprakash K, Chinnaswamy P. Wpływ Spiruliny i Liv-52 na toksyczność indukowaną kadmem u szczurów albinos. Indian J. Exp. Biol. 2005; 43: 773-781.

16. Saha SK, Misbahuddin M, Khatu R, Mammum IR. Wpływ ekstraktu heksanowego Spiruliny na usuwanie izolowanych tkanek wątroby szczura. Mymensingh. Med. J. 2005; 14 Suppl 2: 191-195.

17. King J.The transferases alanina i aminotransferazy asparaginianowe, w: Praktyczna kliniczna enzymologia, Van D. (Ed), Nostrand, London, 1965a, str. 121-138.

18. King J. Hydrolazy - fosfatazy kwasowe i alkaliczne. W: Praktyczna kliniczna enzymologia, Van D. (Ed), Nostrand, London; 1965b, s. 191-208.

19. Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Badanie nadtlenków lipidów w tkankach zwierzęcych za pomocą reakcji kwasu tiobarbiturowego. Anal Biochem; 95: 351-8.

20. Marklund SL, Marklund G. Zaangażowanie ponadtlenkowego rodnika anionowego w autooksydację pirogalolu i wygodny test na dysmutazę ponadtlenkową. Eur. J. Biochem. 1972; 47: 469-474.

21. Sinha AK. Test kolorymetryczny katalazy. Anal Biochem. 1872; 47: 389-394.

22. Bellomo G, Mirabelli F, Dimonte D, Richelmi P, Thor H, Orrenius C i in. Tworzenie i redukcja dwusiarczków zmieszanych z glutationem podczas stresu oksydacyjnego. Biochem. Pharmacol. 1987; 36: 1313-1320.

23. Moron MS, Depierre JW, Mannervik B. Poziomy glutationu, reduktazy glutationowej i aktywności s-transferazy glutationowej w płucach szczura i wątrobie. Biochim. Biophys. Acta.1979; 582: 67-78.

24. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Oznaczanie białka za pomocą odczynnika fenolowego Folin. J Biol Chem 1951; 193: 265-275.

25. Keppler D, Lesch R, Reutter W, Decker K. Eksperymentalne zapalenie wątroby wywołane przez D galaktozaminę. Wyznaczono Mol Pathol. 1968; 9 Suppl 2: 279-290.

26. Mitra SK, Venkataranganna MV, Sundaram R, Gopumadhavan S. Ochronny efekt HD-03, preparat ziołowy, przeciwko różnym czynnikom hepatotoksycznym u szczurów. Journal of Ethnopharmacology 1998; 63: 181-186.

27. Martin P, Friedman LS. Ocena czynności wątroby i badań diagnostycznych. W: Friedman LS, Keefe EB, redaktorzy. Podręcznik choroby wątroby. Churchill Livingston: Harcourt Brace Co; 1998. str. 1-14.

28. Sree Ramamurthy M, Srinivasan M. Hepatoprotekcyjne działanie Tephrosia Purpurcea u zwierząt doświadczalnych. Indian J Pharmacol 1993; 25: 34-36.

29. Maezona K, Mawatari K, Kajiwara K, Shinkai A, Maki T. Wpływ alaniny na ostrą niewydolność wątroby wywołaną przez d-galaktozaminę u szczurów. Hepatology 1996; 24: 1211-1216.

30. Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin MTD, Mazur M, Telser J. Wolne rodniki i przeciwutleniacze w normalnych funkcjach fizjologicznych i chorobach u ludzi. Int J Biochem Celi Biol 2007; 39: 44-84.

31. Wang BJ, Liu CT, Tseng CY, Wu CP, Yu ZR. Efekt ochronny i przeciwutleniający ekstraktu Bupleurum kaoi Liu (Chao et Chuang) i jego frakcjonowane frakcjonowane za pomocą CO2 w stanie nadkrytycznym na uszkodzenie wątroby wywołane CCI4. Food Chem Toxicol 2004; 42: 609-617.

32. Reiter RJ, Tan D, Osuna C, Gitto E. Aukcje melatoniny w redukcji stresu oksydacyjnego. Recenzja. J Biomed. Sci.2000; 7: 444-458.

33. Chang Y, Hsiao G, Chen SH, Chen YC, Lin JH, Lin KH i in. Tetrametylopirazyna hamuje HIF-1alfa, TNF-alfa i aktywowaną ekspresję kaspazy-3 w niedokrwieniu mózgu wywołanym okluzją środkowej mózgu u szczurów. Apta Pharmacol Sin.2007; 28 Suppl 3: 327-33.